Méthodes d'études des micro organismes dans l'environnement¶

Étudier les communautés microbiennes dans leur environnement naturel :

diversité des micro organismes présents dans les écosystèmes
quels sont les micro organismes présents dans un écosystème donné ? diversité spécifique
quelle est leur abondance relative ?
que font-ils ou sont-ils capables de faire ? diversité fonctionnelle des communautés
interactions existantes avec les autres micro organismes
- comment et avec qui interagissent-ils ?

Partie I : La problématique de l'échantillonnage/archivage¶

I. La stérilisation du matériel¶

Pour stériliser du matériel on va utiliser un autoclave (121°C,20 min), stérilisation par chaleur humide ou d'un four poupinel (160°C, 120min) stérilisation par chaleur sèche. On peut stériliser du matériel avec de l'oxyde d'éthylène, des radiations ionisantes ou du gaz plasma. On peut aussi utiliser du matériel stérile à usage unique ou désinfectant sol et surface. En biologie moléculaire du gène on extrait l'ADN et l'ARN.

II. L'échantillonnage des sédiments¶

On fait un échantillonnage à l'aide de carottage ou d'une benne. Cela à pour objectif de :

décrire et comprendre les rythmicités sédimentaires dans le haut estuaire de la Seine
reconstituer les apports en contaminants particulaires à l'estuaire amont
reconstituer l'historique de l'apparition de gènes bactériens de résistance aux contaminants métalliques
rechercher des gènes spécifiques de bactéries pathogènes et des gènes de résistance aux antibiotiques

III. L'échantillonnage de l'eau¶

On échantillonne toujours l'eau à 1m en dessous de la surface et 1m au dessus du fond. Pour prélever le zoo plancton, on utilise des filets à zoo plancton, on utilise des tamis pour récupérer le zoo plancton. On peut prélever de l'eau ponctuellement ou le prélever plusieurs fois sur une échelle de temps déterminée.

IV. La conservation des échantillons¶

Conservation dépend de ce qu'on veut faire ensuite comme approche. Si on veut travailler avec des bactéries cultivables, on les conserve à 4°C. Pour l'ADN on les conserve à -20°C et l'ARN à -80°C. Si on veut conserver des cellules dans leur intégrité, on les conserve à 4°C.

V. Extraction des acides nucléiques¶

Deux grandes approches d'extraction des acides nucléiques :

directe : lyse mécanique et chimique in situ, inconvénient : on libère les acides nucléiques dans l'échantillon, on va avoir tendance à fragmenter l'ADN, contaminants associés, pertes à l'extraction et purification

Co-extraction ADN extracellulaire, fragmentation ADN, contaminants associés, pertes à l'extraction et purification (espèces rares)

indirecte : lyse de bactéries isolée, lavages puis extraction des acides nucléiques, moins fragmenté, moins de contaminants co-purifiés

ADN moins fragmenté, moins de contaminants co-purifiés, biais lié à l'isolement des bactéries (>20-50% bactéries restent associées aux particules du sol)

VI. Représentativité des résultats¶

On analyse trois fois de suite afin d'avoir le plus de fiabilité possible

Partie II : Outils quantitatifs¶

I. Approches culturales¶

Que va-t-on trouver dans un échantillon de l'environnement ?

bactéries cultivables (0,1 à 10%)
bactéries non cultivées
bactéries viables non cultivables
bactéries mortes non lysées
ADN de bactéries mortes et lysées

mésophile : bactérie de culture à température ambiante

psychrophile : bactérie de culture à basse température

thermophile : bactérie de culture à haute température

II. Techniques microscopiques¶

Principe : utilisation de molécules vont rendre la bactérie fluorescente et permettre de quantifier chaque molécule.

Chromophores : molécules excitées à une longueur d'onde qui réémettent de l'énergie sous forme lumineuse à une longueur d'onde supérieure qui va donner la fluorescence.

Flore totale : dénombrement au DAPI¶

Intérêt : quantification de toutes les bactéries (conservé intégrité cellulaire, état 1 à 3 ou 4). Utilisation de deux chromophores : le DAPI (ADN) et l'Acridine Orange (ADN et ARN)

DAPI est un fluorochrome spécifique de l'ADN

complexe ADN-DAPI excité sous lumière UV émet une lumière bleue
DAPI libre, ou lié à du matériel autre que l'ADN, fluorescence jaune
dénombrement possible des bactéries au microscope à épi fluorescence

Outils : DAPI mais on ne sait pas si elles sont mortes ou pas

Fluorochrome spécifique de l'ADN, excité sous la lumière UV émet une lumière bleue. Quand il n'est pas associé à l'ADN, il sera jaune. Mais parfois des particules organo-minérales ont un amas de bactéries. On utilise les ultra sons les bactéries vont être dissociées des particules. On ne peut pas déterminer l'espèce de la bactérie.

Dénombrement des bactéries viables : DVC en utilisant de l'acide nalidixique qui va inhiber la réplication de l'ADN. La bactérie va rester sous forme très allongée.

Sinon : évaluation de l'intégrité membranaire à l'aide de deux marqueurs fluorescents. Le premier marqueur va colorée toutes les bactéries en vert, le deuxième marqueur va coloré en rouge toutes les bactéries mortes car les parois seront abîmées.

Ne permet pas de donner des informations sur la diversité des bactéries. Fastidieux au niveau du dénombrement. Problème d'association avec les particules.

Dénombrement spécifique de micro organismes anticorps fluorescents¶

Anticorps fluorescents : utilisation d'anticorps fluorescents dirigés contre un épitote du micro organisme d'intérêt et sont couplés à une molécule fluorescente.

Intérêt : quantifier spécifiquement certains genres bactéries d'un échantillons de l'environnement. On va dénombrer les bactéries mortes. On a pas les anticorps spécifique de toutes les bactéries, si on ne sait pas les cultivés, on ne va pas les dénombrer.

Technique FISH¶

FISH : utiliser les séquences nucléiques (ADN ou ARNr) pour détecter, quantifier ou identifier les bactéries (toute ou genre ou espèce) d'un échantillon. Séquence cible : ARNr 16S de procaryotes : motifs hautement conservés, motifs variables en fonction de l'espèce moléculaire. Fixation -> perméabilisation. On ne dénombre que les viables car les bactéries mortes ont très peu de ribosomes. Les sondes vont se coller uniquement sur des régions spécifiques des espèces.

Quantification activité enzymatique : permet de quantifier des bactéries viables d'un échantillon d'eau

QPCR : quantification du nombre de copies ADNr 16S par qPCR (amplification de gène) -> copie a partir de fragment d'ADN